Ú v o d

Cytometrické techniky představují jeden z dynamických směrů současného biologického bádání - nacházejí bohaté uplatnění jak v základním, tak aplikovaném výzkumu (zejména lékařském). V průběhu posledních dvou desetiletí se stále častěji objevují i v botanických oborech, kde jsou využívány především k rychlému stanovení obsahu jaderné DNA. Základní předností cytometrických postupů je možnost měření parametrů jednotlivých izolovaných částic (jádra, buňky), díky čemuž jsou elegantně odstraněny možné nepřesnosti způsobené analýzou pouhých průměrných hodnot z velkého počtu objektů (uvedené techniky tedy dovolují získat informace o vlastnostech různých subpopulací částic).

Základní skupiny cytometrických technik představují fluorometrie a densitometrie.

Při fluorometrii bývá velikost jaderného genomu zjišťována na základě množství světla vyzářeného po excitaci fluorescenčního barviva vázajícího se na DNA (např. DAPI či propidium jodid); k detekci zpravidla slouží průtokové cytometry.

Densitometrické techniky naproti tomu zahrnují postupy, které určují obsah DNA podle optických vlastností (optická hustota) analyzované oblasti po jejím obarvení vhodným činidlem (nejčastěji Feulgenovou reakcí). Ke snímání optických parametrů pomocí mikroskopu se používají buď fotometry nebo - v technicky vyspělejších přístrojích - analogové či digitální kamery a výsledný obraz je počítačově zpracován algoritmy obrazové analýzy. Tento soubor pak nese označení image cytometry (= obrazová cytometrie).

Základní vlastnosti obou cytometrických postupů udává následující tabulka:

Vlastnost	Průtoková cytometrie	Obrazová cytometrie
Princip měření	fluorometrie	densitometrie
Rychlost přípravy vzorků	vysoká	nízká
Počty analyzovaných částic	tisíce	desítky až stovky
Možnost fixace materiálu	NE	ANO
Problémy se sekundárními metabolity	vysoké	střední až nízké
Optická kontrola částic	NE	ANO
Další aplikace		klasická analýza obrazu
Dostupnost na přírodovědeckých fakultách v ČR	UK v Praze, UP Olomouc, MU Brno	UK v Praze

A p l i k a c e

Základní biosystematické okruhy řešené s pomocí cytometrických technik jsou: 1) stanovení stupně ploidie, 2) stanovení velikosti jaderného genomu.

Stanovení stupně ploidie

Polyploidizace představuje jeden ze základních procesů v evoluci cévnatých rostlin - podle odhadů náleží až 80 % krytosemenných rostlin a přes 95 % kapraďorostů mezi polyploidy. Cytometrické analýzy umožňují:

• spolehlivou determinaci blízce příbuzných taxonů v polyploidních komplexech
  (četné skupiny cévnatých rostlin obsahují drobné druhy (microspecies), které se pouze nepatrně liší morfologickými znaky, jsou však jednoznačně definovány stupněm ploidie - např. Veronica hederifolia agg., Polypodium vulgare agg.)
• určení hybridních typů mezi rodičovskými taxony s různou ploidií
  (u blízce příbuzných taxonů je spolehlivé odlišení hybridních jedinců většinou mimo možnosti klasického morfologického srovnávání; stanovení ploidního stupně však představuje jedinečnou možnost pro jejich odhalení - např. v rodech Empetrum, Galeobdolon, Oxycoccus)
• studium distribuce cytotypů na různých prostorových škálách (od úrovně kontinentů až po měřítko centimetrů čtverečních)
  (nová oblast rostlinné biosystematiky, která se výrazně otevřela až s nástupem cytometrických technik)
• studium populační cytotypové struktury a dějů ve smíšených populacích více cytotypů
  (jedinečná možnost podrobně testovat např. otázky ekologických preferencí různých cytotypů, míru vnitro- a mezi-cytotypové kompetice, vznik reprodukčně-izolačních mechanismů nebo tlaky, které podmiňují koexistenci více ploidií na stejném stanovišti)
• odhalení endopolyploidie
  (endopolyploidizace je dosti častým jevem v zásobních orgánech a plně diferencovaných pletivech různých rostlinných skupin - rozšířena např. u Brassicaceae, sukulentů, atd. Cytometrické techniky představují nejspolehlivější analytickou metodu k jejímu odhalení.)

Stanovení velikosti genomu

Obsah jaderné DNA je důležitou charakteristikou všech živých organismů. Pro popis této veličiny se používají dva termíny.

• C-hodnota - udává množství jaderné DNA v nereplikovaném haploidním jádru (nezávisle na stupni ploidie; somatické nereplikující se buňky tedy zpravidla mají 2C obsah)
• Cx-hodnota - udává množství jaderné DNA monoploidní chromozómové sádky (u polyploidů se jedná o velikost "průměrné" chromozómové sádky); obecně lze stanovit jako 2C-hodnota / stupeň ploidie

Obě uvedené hodnoty se u diplodních taxonů rovnají, u polyploidů však C-hodnota bývá vždy vyšší než hodnota Cx. Používané jednotky jsou buď pikogramy DNA (=10^-9 g) nebo megapáry bází (1 pg = 978 Mbp).

Data o velikosti genomu nacházejí uplatnění při:

• určování druhů se stejným počtem chromozómů
  (u mnoha skupin se jednotlivé druhy s identickým počtem chromozómů liší jejich velikostí a tím i obsahem jaderné DNA - např. Dryopteris dilatata agg.)
• detekci hybridů z homoploidního křížení
  (kromě rodičovských druhů lze často odlišit i jejich hybridy vykazující tentýž počet chromozómů - např. v rodu Agropyron)
• stanovení genomového složení u allopolyploidních typů
  (chromozómové sádky pocházející od jednotlivých rodičovských taxonů se u allopolyploidů mohou lišit v obsahu jaderné DNA - nabízí se tedy možnost zpětné rekonstrukce jejich původu - např. Musa)
• studium korelací mezi velikostí genomu a dalšími vlastnosti
  (znalost obsahu jaderné DNA často dovoluje predikovat různé fenotypové vlastnosti či fenologické a ekologické chování)
• odhalení agmatoploidie
  (agmatoploidie je neletální fragmentace chromozómů způsobená přítomností difúzní centroméry - vyskytuje se v čeledích Cyperaceae a Juncaceae. Obsah DNA u takových jedinců zůstává konstantní, zvyšuje se však počet chromozómů.)

O d k a z y