Cytometrická laboratoř PřF UK
Hlavní stránkaCytometrické metodyObrazová cytometriePrůtoková cytometrie
ÚvodMetodikaLiteratura

Ú v o d

Obrazová cytometrie je technika sloužící k měření různých kvantitativních parametrů částic založená na mikroskopii a digitální analýze obrazu. Studované objekty jsou snímány pomocí kamery připojené k mikroskopu a převedeny do digitální podoby. Následně je vypočtena jejich optická hustota na základě intenzity šedi jednotlivých bodů (pixelů), z nichž jsou složeny.



M e t o d i k a

Příprava rostlinného materiálu pro obrazovou cytometrii

  1. Fixace
    • fixace pletiv (nejlépe meristematických - kořenové špičky, vzrostné vrcholy) v methanolové fixáži (methanol : ledová kys. octová 3 : 1) v chladu (4 oC) po dobu 24 hod
    • alternativně lze použít fixaci ve 4% formaldehydu v chladu (4 oC) po dobu 1,5 hodiny, poté opláchnutí methanolovou fixáží
      (tento postup je vhodný zejména pro druhy s vysokým obsahem polyfenolů)
    • vzorky lze uchovat v 96% ethanolu při -20 oC

  2. Hydrolýza
    • hydrolýza pletiv v 5M HCl při 20 oC (nutno dodržet přesnou teplotu !) po dobu 60 min (při použití methanolové fixáže) či 75 min (při použití formaldehydové fixáže)
    • ukončení hydrolýzy opakovaným promytím v destilované vodě

  3. Barvení
    • obarvení vzorků Schiffovým činidlem po dobu ca 24 hod při 4 oC
    • proplachování materiálu po dobu ca 45 min při pokojové teplotě v SO2 vodě

  4. Roztlak
    • roztlačení pletiv na podložním sklíčku (důležité je dosažení jediné vrstvy buněk)
    • odstranění krycího sklíčka na chladící plotně
      (následně lze vzorky rychle opláchnout 96% ethanolem)
    • vysušení preparátů při pokojové teplotě (ca 60 min)
    • životnost je možné prodloužit zarámováním pomocí DPX

Současně s analyzovaným materiálem je vždy nutné připravovat i vzorky referenčního standardu (materiál se známým obsahem jaderné DNA). Vhodný primární standard představuje Pisum sativum (druh bez sekundárních metabolitů poskytující optimální výsledky).



Ukázka výsledného preparátu pro stanovení obsahu jaderné DNA



Postup měření optické density pomocí image cytometru

  1. Nastavení image cytometru
    • vložení zeleného pásmového (band-pass interference) filtru (540 nm)
    • nastavení 40x suchého objektivu (alternativně lze využít suché či imerzní objektivy s větším zvětšením - 60x, 100x)
    • zajištění rovnoměrného osvětlení pole pomocí Köhlerova principu

  2. Stabilizace systému a kontrola linearity
    • zahřátí na stabilní teplotu po dobu ca 60-90 min
      (na počátku měření dochází k postupnému zahřívání kamery a nežádoucí elektronové excitaci, která se může projevit fluktuacemi měřených optických parametrů)
    • kontrola linearity použitím neutrálních filtrů se stanovenou světelnou propustností (např. T = 1,5 - 6 - 9 - 25 - 40 - 45 - 80 %)

  3. Kalibrace systému na nulovou hodnotu
    • zaostření na oblast preparátu neobsahující žádné objekty a nastavení dané optické density jako nulové hodnoty

  4. Softwarové korekce
    • korekce nerovnoměrného osvícení snímaného pole
      (snížení vlivu rozdílných optických parametrů v centru a při okraji pole)
    • korekce lokálního pozadí každého objektu
    • korekce odlesků a rozptylu světla

  5. Měření optické denzity
    • automatické či manuální snímání optické denzity objektu umístěného v centru sledovaného pole
    • výstupem analýz zpravidla bývá histogram, kde x-ová osa určuje relativní hodnotu optické denzitu a y-ová osa počet částic s danou intenzitou
    • analýza vybraných jader v časné profázi (2C obsah) a pozdní telofázi (4C obsah)
      Vzhledem k jasně definované jaderné fázi postačuje pro získání kritických výsledků měření malého počtu částic (např. 10 pro každý typ). Výsledný histogram bude obsahovat dva jasně oddělené píky srovnatelné velikosti, které odpovídají jádrům s 2C a 4C obsahem DNA.
    • analýza interfázových jader
      Měření náhodně vybraných částic je vhodné u vzorků s nízkou mitotickou aktivitou, kdy převažují interfázní jádra (z analýz je nutné vyloučit objekty od pozdní profáze do časné telofáze kvůli silné spiralizaci chromatinu). Počet analyzovaných částic je však nutné výrazně navýšit (na několik stovek) vzhledem k vyšší variabilitě dané přítomností různých fází jaderného cyklu. Výsledný histogram bude obsahovat výrazný pík odpovídající jádrům s 2C obsahem DNA, menší pík odpovídající jádrům s 4C obsahem DNA a signály ležící mezi těmito vrcholy, které odpovídají jádrům v S-fázi cyklu.

Princip měření optické denzity objektu (segmentace do jednotlivých zón a jejich porovnání s nulovou hodnotou).

Optimální histogram získaný při analýze profázických a telofázických jader.Histogram ukazující na metodicky obtížný materiál (s vysokou koncentrací taninů).



Standardizace

Informace o analyzovaném objektu je vždy nutné vztahovat k parametrům referenčních materiálu (standardu).
V obrazové cytometrii lze využít dva typy standardizace:


Požadavky na kvalitu analýz

  1. Uniformita signálu
    • variační koeficient (CV) měřeného parametru (nejčastěji optická denzita) u jader s 2C nebo 4C obsahem DNA nesmí v tomtéž preparátu přesáhnout 6 %. Vyšší hodnoty jsou akceptovatelné jen u materiálu s velmi nízkým obsahem jaderné DNA (např. Arabidopsis thaliana).

  2. Linearita
    • vzájemný poměr optických denzit pro 2C a 4C jádra se nesmí od ideální hodnoty 2,0 lišit o více než 5 % (podíl 4C / 2C tedy musí ležet v rozmezí 1,9 - 2,1)


L i t e r a t u r a